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三代测序


PacBio Sequel测序仪是Pacific BioSciences最新开发的基于单分子实时(SMRT)测序技术的最新第三代测序平台,平均测序读长可以达到15Kb,最长读长可达40-60Kb。测序系统包含16个SMRT cell测序模块,每个SMRT cell可产生5-10Gb数据。同时,SMRT技术无需扩增即可对单个DNA分子进行测序,有效避免了PCR扩增造成的GC偏好性,实现序列覆盖的完整性和均一性。目前PacBio单分子实时测序技术也已广泛应用于复杂基因组组装和真核生物全长转录组测序。


基因组组装


与现有二代短读长测序技术相比,PacBio SMRT测序的长读长可以有效解决基因组组装难题,对于如简单重复序列、回文序列、反向重复、转座子等短读长技术无法发现或不能定位的基因组复杂结构区域能够很好的解决。PacBio SMRT长读长测序技术结合BioNano单分子光学图谱技术可进一步提高基因组从头组装效果,可以在较短时间内获得测序物种的完整基因组草图,拼接得到的contig和scaffold要远大于基于二代测序拼接的结果。


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全长转录测序


基于二代高通量测序平台的转录组测序(RNA-seq)凭借其高通量和低成本在过去的几年中得到广泛应用,然而读长的限制使得其无法得到精确完整的转录本。

PacBio SMRT技术平均达15Kb的超长读长可以检测从5’末端到3’末端的完整转录本,实现无需拼装的全长转录本分析,从而发现新基因、新可变剪切形式、基因融合事件以及反义转录本,为表达定量分析提供准确的组织特异性转录本集合,进行等位基因特异性表达分析,已成为复杂转录组研究的革命性技术。


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技术路线


基本流程图1 (3).png

项目时间


环亚娱乐标记从收到样本到完成客户所需的分析一般需要60天到120天不等,如果客户需要订制化服务则可能需要更长的时间。

经典案例


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复活草(Oropetium thomaeum) 是一种高度耐旱的禾本科植物,在遭受极端干旱后获得水分可以再度生长。

Mockler研究组采用PacBio SMRT技术对复活草基因组进行了72X深度测序,组装为625个contig,覆盖了99%的基因组(245Mb中的244Mb),N50达到2.4Mb,组装精度达到99.99995%,包括了端粒和着丝粒序列、长末端重复序列、反转录转座子、串联重复基因,和其他难于组装的基因组元件。

研究人员进一步结合由200X的BioNano光学图谱数据构建的基因组物理图谱,将上述contig进一步组装为scaffold,共得到46个主要scaffold覆盖了94%的组装结果,N50达7.8Mb,获得了完整的基因组草图。

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Doreen Ware研究组利用PacBio SMRT 全长转录组测序技术,对来源于玉米自交系B73的六种组织(根、花粉、胚、胚乳、幼穗和幼雄穗)进行转录组测序。

分析结果鉴定出111,151个独特的可变剪切体,对应约27,000个基因,该数量几乎是目前参考转录本数目的两倍。

去除转座子后,研究人员将剩余的可变剪切体和玉米参考基因组进行了比较,结果表明,3%的剪切体为来自新基因的新转录本,57%的剪切体是至少与参考基因组注释基因共享一个剪切位点的新异构体。

通过与二代高通量测序数据比较发现,在PacBio数据中,平均86%的剪接点都有短读长数据的支持。

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